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      談談RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質體腦靶向的作用論文

      時間:2021-04-06 10:22:13 論文 我要投稿

      談談RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質體腦靶向的作用論文

        治療腦內疾病的必要途徑需將藥物靶向性輸送入腦內。以腦靶向性的蛋白或多肽作為載體,可能會實現藥物的腦靶向轉運。我們實驗室以往的研究表明,狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide),可攜帶核酸、蛋白等生物大分子入腦。脂質體是一種安全有效的藥物遞送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂質體內核中,在體內安全釋出以發揮作用。此外,脂質體較易修飾,從而可使其具有靶向性和高效性。本研究將在脂質體表面的PEG鏈端連接RDP多肽,以具有抗腫瘤效果的天然植物提取物姜黃素為模型藥物,研究該RDP修飾脂質體的腦靶向作用,從而可能為向腦內送脂溶性化合物以治療腦部疾病,提供一種嶄新的途徑和方法。

      談談RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質體腦靶向的作用論文

        1 材料與方法

        1.1 試劑

        姜黃素,純度>98%,購自美國Sigma公司;大豆卵磷脂、膽固醇,純度>95%,均購自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000),購自美國Nanocs公司;Cys-RDP,純度>95%,購自上海吉爾公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

        1.2 儀器

        高效液相色譜儀(包含SPD-M20A檢測器和LC-20AD泵),購自日本島津公司;激光粒度及zeta電位分析儀(NanoZS),購自英國馬爾文公司;生物質譜儀autoflexspeedMALDI-TOF/TOF,購自德國BrukerDaltonic公司;AB135-S電子分析天平,購自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮氣吹干儀,購自上海八方世紀科技有限公司;XHF-D高速分散器,購自寧波新芝生物科技有限公司。

        1.3 細胞株及培養體系

        人腦星形膠質母細胞瘤細胞U-87MG(實驗室凍存),采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養基培養,置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養箱內。隔天換液,待細胞密度長至80% ~90%時,按照1∶3的比例傳代。傳代時,加入消化液一定時間后去除,用培養基吹打成單個細胞懸液,取生長良好、活性大于98%的細胞進行后續實驗。

        1.4 實驗動物

        昆明小鼠80只,♂各半,體質量(20±2)g,購自于重慶滕鑫生物技術有限公司。小鼠飼養于西南大學藥學院SPF小鼠飼養室,恒溫、恒濕,自由進食、進水。

        1.5 脂質體的制備和表征

        1.5.1 導向化合物的合成

        按照摩爾比2∶1的比例精密稱取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中,然后加入20μL的N-甲基嗎啉,置于4mL離心管中,在攪拌器中避光攪拌48h。取出反應液,置于透析袋(MW 3500)中,放入2L去離子水中透析48h后(每6h換水1次),冷凍干燥,-20℃保存。

        1.5.2 脂質體的制備

        采用薄膜分散法分別制備姜黃素脂質體(CUR-L)和RDP修飾的姜黃素隱形脂質體(RDP-CUR-L)。按照處方量(Tab1)精密稱取各種脂材于10mL茄形瓶中,加入氯仿3mL溶解,37℃減壓旋轉蒸發10min,使其成均勻的薄膜。然后加入1mL去離子水,37℃于水浴搖床中水化1h,形成懸浮液,間歇超聲90s,得到澄清透明呈淡黃色乳光的脂質體溶液,并分別過100nm的膜使粒徑分布均勻,4℃冰箱內保存。

        1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例篩選

        按上述脂質體制備方法制備一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含藥靶向脂質體(DSPE-PEG-RDP分別為總摩爾量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L對U87MG細胞抑制率的影響。取對數生長期狀態良好的細胞,用0.25%胰酶消化液消化后,調整細胞濃度為5×107·L-1,以每孔500μL(5000個/孔)接種于96孔板,培養24h貼壁后加入不同濃度的CUR-L和RDP-CUR-L,濃度依次為150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1,孵育48h后,棄去培養基,每孔加入濃度為5g·L-1的MTT(20μL),37℃培養4h,棄去培養液,每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍紫色甲#顆粒,用酶標儀在波長為490nm下測定光吸收值(OD)。每組實驗重復3次,每個樣品做3個平行樣。全部實驗均設DMSO對照組。計算藥物抑制率和對腫瘤細胞的半數抑制濃度(IC50)。藥物抑制率/% =(1-OD實驗組-OD空白組/OD對照組-OD對照組)×100%1.5.4 脂質體粒徑、電位、分散度測定 用激光粒度及zeta電位分析儀分別測定CUR-L和RDP-CUR-L的粒徑、Zeta電位、分散度(PDI)。

        1.5.5 脂質體包封率測定

        采用透析破乳法,取用均質機處理過的CUR-L和RDP-CUR-L,每組實驗分成兩份(每份400μL):一份用透析液透析6h后,收集脂質體部分,以10%的TritonX-100破乳,經HPLC測定包裹在脂質體內的藥物濃度C;另一份直接破乳,經HPLC測定姜黃素得到C0,按照公式計算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

        1.5.6 脂質體穩定性考察

        取制得的CUR-L和RDP-CUR-L,分成兩個實驗組,每組平行3次,分別于3、7、15、30、45、60d后肉眼觀察脂質體溶液變化,HPLC測包封率。

        1.5.7 體外釋放度測定

        采用動態透析法(dynam-icdialysis),按中國藥典2010版附錄XC第三法(小杯法)測定釋放度。精密量取制劑CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL,經釋放介質稀釋至3mL,裝于透析袋內(截留分子質量為8000u),兩端扎牢,放入150mL釋放介質中,釋放介質為含有0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液,37℃ 下姜黃素在此釋放介質中的溶解度為80mg·L-1,滿足漏槽條件。37℃恒溫水浴攪拌(轉速為100r· min-1)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各個時間點取樣0.3mL,并及時補充等溫的相同體積空白介質。微孔濾膜過濾,按照HPLC方法檢測姜黃素含量,并計算累積釋藥百分率(%)。

        1.6 姜黃素懸浮液和脂質體的體內分布

        1.6.1 色譜條件

        C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm,大連依利特分析儀器公司);流動相:乙腈∶4%冰醋酸(48∶52),流速:1mL·min-1,檢測波長:430nm,柱溫:25℃。

        1.6.2 樣品預處理

        將姜黃素溶解于1%羧甲基纖維素鈉中,配制成濃度為1g·L-1的CUR混懸液,制得的CUR-L和RDP-CUR-L濃度均為1g·L-1,CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黃素30mg·kg-1的劑量于小鼠尾靜脈注射給藥。取昆明小鼠,禁食12h,尾靜脈分別注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L,于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各個時間點分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦(每個時間點3只),用生理鹽水清洗后用濾紙吸干,剪碎,精密稱重,加入1mL生理鹽水,用組織勻漿器勻漿,加入1mL乙酸乙酯,渦旋3min,3000r·min-1離心10min,精密吸取上清液,再加入相同體積的乙酸乙酯,萃取2次,合并上清液,氮氣吹干,加入10倍體積的流動相,超聲、渦旋使其充分溶解,過膜后進樣。

        1.6.3 方法學考察

        專屬性:取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各空白組織勻漿液0.3mL,樣品處理后采用HPLC法分別進樣測定空白樣品、空白樣品加內標及小鼠尾靜脈注射給藥后的樣品。標準曲線:取小鼠空白組織勻漿液,精密加入姜黃素標準溶液,配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列濃度的樣品溶液,樣品處理后,以姜黃素的峰面積與樣品中姜黃素的濃度(C)進行線性回歸;厥章逝c精密度:配制低、中、高濃度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黃素質控樣品,各5份,按“樣品處理”項下方法處理,進樣測定。以姜黃素的峰面積代入標準曲線方程,計算出姜黃素的濃度,與實際加入量比較,計算方法回收率,用以表示準確度;以相應低、中、高濃度的姜黃素對照品溶液直接進樣,以質控樣品中姜黃素峰面積與對照品溶液中姜黃素峰面積比較,計算提取回收率;1d內進樣測定5次,連續測定5d,計算日內RSD和日間RSD。

        2 結果

        2.1 脂質體的制備和表征

        2.1.1 導向化合物的合成 生物質譜分析反應產物DSPE-PEG-RDP的結果如Fig1所示。RDP相對分子質量為3671,DSPE-PEG-NHS分子質量為3094,得到的產物DSPE-PEG-RDP相對分子質量約為6800,說明導向化合物制備成功。

        2.1.2 脂質體的粒徑、zeta電位、分散度及包封率 CUR-L和RDP-CUR-L粒徑、zeta電位、分散度和包封率如Tab2所示。結果表明,CUR-L粒徑為(81.20±5.13)nm,而RDP-CUR-L經RDP修飾過后粒徑為(98.56±6.97)nm,分散性良好,包封率均大于85%,制備重現性較好。

        2.1.3 脂質體穩定性 CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后,溶液依舊澄清透明,呈淡黃色乳光,與新制備時相比無明顯變化。不同時間點測其包封率,可以看出RDP修飾對姜黃素脂質體包封率影響不大,60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右,可見穩定性良好。

        2.1.4 導向化合物DSPE-PEG-RDP比例篩選 結果如Fig3所示,當加入的DSPE-PEG-RDP為總摩爾量的1.0%時,RDP-CUR-L對U87細胞的抑制作用明顯優于CUR-L(P<0.01)。隨著DSPE-PEG-RDP比例的增加,U87細胞的存活率逐漸降低,這表明在脂質體的PEG鏈端連接RDP能增強對U87細胞的抑制作用,當加入比例達5.0% 時,RDP-CUR-L對U87細胞的抑制作用最強,與0.5%時相比差異有顯著性(P<0.05)。當比例超過1%時,RDP-CUR-L對U87細胞的抑制變化不明顯,表明繼續增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L對U87細胞的抑制率。密度篩選實驗結果表明,DSPE-PEG-RDP的加入比例能影響脂質體的`靶向效率。出于實驗效果和經濟性考慮,選取加入比例為1.0%進行以下的實驗

        。2.1.5 體外藥物釋放 由于姜黃素在水中幾乎不溶解,采用加入2% 十二烷基硫酸鈉(SDS)的人工胃液為釋放介質,考察姜黃素制劑的釋藥情況。結果如Fig4所示,CUR-L在前6h內大量釋放,累計釋放量接近60%,而后進入慢速釋放期,12h釋放量約為80%,而RDP-CUR-L釋放在該釋放介質中較慢,6h后釋放約45%,24h后累積釋放量不到80%,表明RDP-CUR-L有著更好的緩釋作用。

        2.2 姜黃素懸浮液和脂質體的體內分布

        2.2.1 方法學考察

        在上述色譜條件下,方法專屬性良好,峰形良好,保留時間約為14min,組織中的內源性物質不干擾樣品測定,見Fig5。樣品中的姜黃素在1.5625~50mg·L-1線性關系良好(r=0.9994)。方法回收率為(95.87±4.98)%,高、中、低3個濃度的提取回收率分別為(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5),日內精密度和日間精密度小于15%,均符合生物樣品分析方法的要求。

        2.2.2 體內分布和腦靶向作用考察

        小鼠尾靜脈注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同時間各組織中的姜黃素分布見Fig6。注射CUR后,隨著時間的推移,姜黃素在各個臟器中含量逐漸減少,姜黃素大量分布在肺、肝、腎等臟器中,心、脾中也有少量分布,然而由于血腦屏障的作用,腦部并未檢測到姜黃素。注射CUR-L后,由于易被網狀內皮系統吞噬,姜黃素主要分布在肝、腎、肺中,在腦、脾中少量分布,而在心臟中沒有檢測到姜黃素。RDP-CUR-L經尾靜脈給藥后大致分布與CUR-L類似,但在腦中檢測到大量的姜黃素,并且在小鼠體內的滯留時間明顯延長,24h仍然能在腦中檢測到姜黃素。

        3 討論

        脂質體作為藥物載體具有使藥物被動靶向網狀內皮系統、延長藥物作用時間、減少藥物不良反應、提高療效等優點。表面經柔性高分子PEG修飾,增大了脂質體的空間位阻,同時提高了膜表面親水性,使得其不易被網狀內皮系統(reticularepithelialsystem,RES)攝取,因而PEG化的脂質體較普通脂質體更長效。雖然脂質體經PEG修飾后能夠延長在體內的循環時間,增加在腫瘤組織中的聚集,但是由于“PEGdilemma”現象的存在,阻礙了腫瘤細胞對脂質體的內吞,故在脂質體的PEG鏈端連接靶向配體如葉酸、轉鐵蛋白、抗-EGFR抗體等,使得靶向配體與腫瘤細胞過度表達的受體特異性結合,通過“配體-受體”特異性識別與結合作用,能夠促進細胞對載體的$吞,增加藥物的抗腫瘤效果,并且可以定向地將藥物運送到靶部位,實現對腫瘤組織的“主動靶向”。脂質體或者納米粒子表面修飾特異性配體或受體,主動靶向特定腫瘤組織的文獻已有大量報道。一些常見的細胞穿膜肽,如TAT、多聚Arg、轉運素,已被證實能夠在體外將核酸、蛋白等小分子物質轉導入培養的細胞。Khafagy等研究發現,L-型穿膜肽penetratin可以明顯增加胰島素的滲透性,從而使其穿過鼻膜,并不會對鼻吸收黏膜上的細胞完整性造成明顯的破壞。據文獻報道,另一個從狂犬病毒糖蛋白衍生出的一個小肽與多聚Arg連接后,能夠輸送siRNA靶向性地進入中樞神經系統,導致相關基因沉默。KaiPharmaceutical公司應用Tat引導蛋白激酶C抑制劑的蛋白調節子,用于腦缺血和急性心肌缺血的治療,并且已于2007年進入了Ⅱ期臨床試驗。然而,用細胞穿膜肽引導脂質體等納米載體進入特定的組織,特別是腦組織的文獻卻并不多見。普通CPPs雖然能介導各類分子入胞,但是其缺乏細胞特異性,而本實驗中所用的細胞穿膜肽RDP是一種來源于狂犬病毒糖蛋白RVG,并經過結構改造而得到的一種能靶向中樞神經系統、具有很強嗜神經性的衍生肽,同時具有良好的穿膜特性和對神經細胞的高度選擇性。

        實驗室前期研究已表明RDP能夠引導核酸、多肽等小分子物質入腦,而本實驗中通過體內分布實驗證明了RDP連接的姜黃素脂質體在體內運輸過程中沒有發生斷裂,確實能夠攜帶包裹了姜黃素的脂質體入腦,不僅僅擁有理論意義,也具有潛在的應用價值。這為腦部疾病的治療提供了新的思路。

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